烟草是我国重要的经济作物之一[1]。周期1～2年的自然醇化过程是提高烟叶品质和可用性的重要环节[2,3],然而，在这一贮藏期间，烟叶的品质却极易受到霉菌的影响而降低甚至完全丧失[4]。储烟发生霉变后，其原有的香味消失，口感下降；霉变进一步恶化后，甚至会产生对人体有害的毒素，给消费者的吸食带来安全隐患[3,4,5,6]。烟叶的霉变与仓储环境息息相关，仓储环境中霉菌的蔓延是导致储烟霉变的重要原因之一[4,7,8,9]。因此，定期对储烟仓库的环境进行防霉处理，有助于提高烟叶品质。化学抑霉剂是目前防治霉变的重要手段之一[5,10,11,12],能够在一定程度上抑制霉菌的蔓延，但化学抑霉剂的使用同样会改变烟草的吸味，且化学成分的残留也会对消费者的吸食安全形成威胁[11]。因此，寻找一种经济、高效、安全、绿色的新型抑霉剂变得愈发重要。植物精油因其独特的组成成分及特有的生物活性，在食品、抗菌、抑菌及医药等方面均受到广泛应用[13,14,15]。据报道[16,17,18],丁香精油对G+与G-细菌、霉菌及酵母均具有较强的抑制作用，肉桂精油对黄曲霉、黑曲霉、黄绿青霉及灰绿曲霉四种粮食储藏中常见的霉菌具有明显的抑制作用，山苍子精油对多种细菌及真菌具有明显的抑制作用。本实验选取从丁香、肉桂和山苍子3种天然植物中提取的植物精油，通过抑菌圈实验，对供试精油的抑霉活性进行研究，以期为进一步研究植物精油抗菌的应用及其抗菌机理提供科学依据。

试剂：本实验所用霉菌菌种在湖北中烟工业襄阳肖湾备料仓库墙面采集获得，通过形貌鉴定A菌株为黑曲霉，B菌株为棕曲霉。肉桂、丁香及山苍子精油均从武汉同仁堂药业公司购买原料并由本实验室提取。PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)、PDB(马铃薯葡萄糖肉汤培养基)购于北京酷来搏科技有限公司。其他生化试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

仪器：立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50SI)来自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，超净工作台(FJCJ2FD)来自苏州苏洁净化设备有限公司，微生物培养摇床(NS-100B)来自杭州聚同电子有限公司，电热恒温培养箱立式生化培养箱(HN-60BS)来自金西蒙(美国)国际集团有限公司。

实验所用A、B菌种采自湖北中烟有限责任公司襄阳卷烟厂某仓库，经菌种筛选获得仓库墙面霉菌优势菌种。

将配制的200 mL PDA培养基进行高温灭菌，取少量菌液进行斜面培养，于28 ℃恒温培养箱中孵育72 h后，挑取活化后的单菌落转至装有PDB培养基的摇瓶中，于28 ℃恒温摇床中继续孵育72 h。从摇瓶中取适量菌液加入无菌去离子水稀释得到霉菌悬液，备用。

以正己烷为稀释液，将丁香精油、肉桂精油和山苍子精油分别按照100%、50%和10%的浓度稀释备用。另外按1∶1的质量比将任意两种精油混合后得到复合配方，备用。

将配制的200 mL PDA培养基进行高温灭菌，待自然冷却至40 ℃左右摇匀并倒平板，每皿25 mL,静置、凝固制得琼脂糖平板。采用涂布法将2.2小节中制得的A、B菌株悬液接种至平板。将直径为15 mm、分别经不同实验组精油浸泡处理后的圆形滤纸放置于平板中心。以浸泡正己烷处理的圆形滤纸为空白对照。将平板在28 ℃的恒温培养箱中培养72 h, 通过游标卡尺测量不同平板中的抑菌圈直径。

将A、B两种菌株的菌种冻存液各取两支进行平板培养，持续孵育72 h后的结果如图1中所示。其中，A菌菌落(图中圈出)初始为白色，后变为深褐色，经形态比对后鉴定为黑曲霉[19]。B菌菌落(图中圈出)较厚，菌丝为白色，经形态比对后鉴定为棕曲霉[20]。

图1 菌种复苏活化情况  下载原图

通过抑菌圈实验研究了三种精油对烟草原料仓库墙面霉菌的抑制作用，结果如图2所示，测得的抑菌圈大小见表1。如图3所示，各供试精油均对两种菌有一定的抑制作用，且与浓度呈正相关。在A菌和B菌的抑制实验中，表现最好的是肉桂精油，10 %浓度下的抑菌圈大小分别是80 mm和45 mm。对A菌而言，抑制效果最佳的是肉桂精油，其次是丁香精油和山苍子精油；对B菌而言，抑制效果最佳的是肉桂精油，其次是山苍子精油和丁香精油。另外，按1∶1质量比配方所得的复合精油抑菌圈实验的培养结果如图2d所示，培养皿中无肉眼可见的菌落生长，表明该配方对霉菌有较强的抑制作用。

表1 各植物精油抑菌实验中的抑菌圈大小 导出到EXCEL

图2 天然植物精油的抑菌活性实验培养结果  下载原图

(a)丁香精油(b)肉桂精油(c)山苍子精油(d)复配精油

图3 天然植物精油抑菌实验中的抑菌圈大小  下载原图

(a)丁香精油(b)肉桂精油(c)山苍子精油

植物精油作为一种新型的烟草仓储抑霉剂，具有经济、安全、高效、绿色等优点。通过抑菌实验对三种天然植物精油的抑霉活性进行研究，结果表明在两种供试菌种抑制作用的研究中，精油的抑制活性从强到弱依次为肉桂精油、山苍子精油、丁香精油，且精油的抑霉活性与其浓度呈正相关，浓度越高其抑霉作用越强。同时，结果显示任意两种精油通过1∶1质量比复配后得到的混合精油也保持了较高的抑霉活性。今后可分馏出精油发挥抑霉作用的主要成分进行实验，为进一步推进精油抑霉剂的应用提供理论参考。